Метод ифа что это

Image 570

Среди методов анализа крови (ссылка на 3-ю статью в этом файле), позволяющих оценить способность организма противостоять инфекционным болезням и  показывающих фазу болезни, важное место занимает иммуноферментный анализ (ИФА). Проведение этого исследования позволяет всесторонне оценить деятельность защитной функции крови и выявить состояние иммунодефицита при инфекционных патологиях, также заболеваниях крови, аутоиммунных процессах, гормональных проблемах.

Каким же образом удается охватить столько целей в одном анализе, и какие имеются показания для его проведения? Попробуем разобраться.


Оглавление:   Что такое анализ крови, проводимый методом ИФА  Какие бывают иммуноглобулины  Показания к назначению иммуноферментного анализа крови  Как проводится ИФА крови  Преимущества метода иммуноферментного анализа крови  Есть ли недостатки у ИФА крови?  Иммуноферментный анализ крови в паразитологии  

Что такое анализ крови, проводимый методом ИФА


immunoglobulins-h4eЭто лабораторное исследование, которое позволяет определять наличие специфических антител (защитных факторов крови белковой природы) к определенным антигенам (болезнетворным агентам). Среди антител первостепенное значение имеют иммуноглобулины, которые могут существовать в виде иммунокомплексов.

Иммуноглобулины вырабатываются вследствие сложных нейрогуморальных  реакций  иммунитета человека, возникающих как ответная реакция на внедрение чужеродных антигенов. На каждый вид болезнетворного агента вырабатываются свои специфические антитела. Действуют они путем «связывания» антигена или патологического микроорганизма, образую комплексное соединение «антиген-антитело» с последующей нейтрализацией, ферментативным лизисом, реакциями фагоцитоза и выводом из организма.

Обратите внимание: именно по наличию определенных комплексов методом ИФА определяется вид возбудителя или имеющегося у больного вредного вещества.

Узнать базовые принципы функционирования иммунитет человека вы сможете, посмотрев данный видео обзор:


Какие бывают иммуноглобулины

Открыто и изучено 5 основных классов иммуноглобулинов – IgА, IgM, IgG, IgD, IgE.  роль остальных еще до конца не выяснена и она находятся в стадии научного исследования.

Обратите внимание: наиболее важное в практической медицине значение имеют иммуноглобулины классов – А, М и G. Информативность определения основана на разных временных промежутках их появления, максимума и исчезновения.

Рассмотрим этот вопрос более детально.

image020

Основная задача иммуноглобулина А (IgA) заключается в защитных функциях слизистых оболочек дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта и мочевыделительной системы. При остром начале заболевания выявить их невозможно. Появляются эти защитные комплексы лишь со 2 недели начала заболевания, иногда позже. Основная масса иммуноглобулина А сосредоточена в слизистых тканях. Ориентировочно около 80%. Остальные антитела циркулируют в крови. Основная функция – обезвреживание и уничтожение микроорганизмов. После стихания острых проявлений заболевания количество этих иммуноглобулинов начинает уменьшаться и полностью уходит на сроке до 8 недель после начала болезни. Если IgA обнаруживаются в более поздние сроки, то это свидетельствует о хронизации процесса.


Главными и первыми маркерами острой фазы развивающейся патологии являются иммуноглобулины класса М (IgM). Обнаруживаются они к 5 суткам начала недомогания. Определить их наличие в крови можно около 6 недель. Затем они начинают быстро исчезать.

Остаточный иммунный ответ характеризует наличие в крови иммуноглобулинов класса G (IgG). Появление этих факторов в крови обнаруживается примерно через месяц после начала болезни. В дальнейшем они могут определяться в течение многих месяцев, лет и даже всю жизнь, выполняя защитную функцию от возврата (рецидива) болезни, а в некоторых случаях делая невозможным  вторичное развитие патологии. Если же количество иммуноглобулина G начало вновь расти, то можно подозревать повторное заражение. Подобный вывод можно сделать путем проведения двух-трех проб, сделанных с промежутком в 2 недели.

Иммуноглобулин Е (IgE) используется в практике паразитологии.

Иммуноглобулин D (IgD) располагается на B-лимфоцитах, находится в небольшой концентрации у здоровых людей. После 10 года жизни достигает максимальных значений. Количество иммуноглобулина D увеличивается при беременности, у больных системными заболеваниями соединительной ткани, бронхиальной астмой, заболеваниями, вызванные иммунодефицитным состоянием.

Показания к назначению иммуноферментного анализа крови

Определение антител к наличию в организме болезнетворных микробов, вызывающих:

  • сифилис;
  • трихомоноз;
  • уреаплазмоз и микоплазмоз.

Имеется рост количества иммуноглобулинов и при глистных инвазиях.

Диагностика проводится для обнаружения:

  • герпетических заболеваний;
  • группы вирусных гепатитов;
  • вируса Эпштейна-Барра;
  • цитомегоаловируса.

При помощи ИФА можно определять наличие антител к 600 видов аллергенов, обнаруживать состояние иммунодефицита, проводить комплексное обследование перед трансплантологическими операциями, проводить комплексный анализ на предмет эффективности лечения.

ИФА является дополнительным методом обнаружения онкологических клеток.

Как проводится ИФА крови

Image 571Для иммуноферментного анализа в большинстве случаев используется кровь пациентов, иногда производят забор ткани стекловидного тела, жидкости спинномозгового канала, околоплодных вод.

Кровь набирают через инъекционную иглу в шприц из локтевой вены. Исследование проводят натощак. Следует помнить, что прием некоторых медицинских препаратов может влиять на результат анализа. Перед сдачей крови необходимо воздержаться от курения, приема алкоголя. Исказить результаты может прием наркотических веществ.


В случае отрицательных значений иммуноглобулинов IgM, IgG, IgA можно говорить об отсутствии заболевания или его начальной фазе, также результат с минусами возможен при полном выздоровлении по прошествии значительного количества времени.

Если IgA и IgM не обнаружены, а IgG проявляется положительно, то по всей вероятности речь идет о сформированном иммунитете после инфекционного заболевания, или после прививки.

ИФА1В случае высокого титра IgM при отрицательных значениях IgG, IgA можно делать вывод о наличии остро протекающего инфекционного заболевания.

Одновременные положительные значения результатов иммуноглобулинов – IgA, IgM, IgG характерны для острой фазы рецидива имеющегося хронического заболевания.

Для хронической инфекции, находящейся в фазе стихания процесса (ремиссии) ИФА показывает отрицательные значения иммуноглобулина M (IgM), при этом результат иммуноглобулинов G (IgG) и A (IgA) будет положительным.

Преимущества метода иммуноферментного анализа крови

Главными достоинствами метода ИФА являются:

  • невысокая себестоимость анализа;
  • диагностическая специфичность, точность;
  • динамический контроль (повтор анализа для определения эффективности лечения и стадий заболевания);
  • возможность проведения массовых обследований в очагах инфекции;
  • скорость получения результата;
  • относительная простота анализа;
  • возможность использования информационных технологий в обработке;
  • безопасность и безболезненность для пациента.

Есть ли недостатки у ИФА крови?

Главным отрицательным моментом исследования является возможность получения ложноотрицательных и ложноположительных данных. Причиной недоразумений могут стать технические недочеты, прием медикаментов, который может исказить картину.

Обратите внимание: фальсифицировать результат анализа может нарушение обменных процессов в организме. Осторожность в выводах надо соблюдать при сочетании нескольких хронических процессов у больного.

Иммуноферментный анализ крови в паразитологии

fighaematobium-144AF75661E07D1898BВозможность применения ИФА в диагностике паразитарных заболеваний определяется специфическим иммуноглобулином E (IgE), который имеет тенденцию к повышению именно при этой группе заболеваний. Кроме того, иммуноглобулин Е является маркером атопических реакций связанных с аллергическими процессами. В крови он находится в незначительных количествах. Основная его локализация – слизистые оболочки, базофилы, маркофаги. Главная функция этого белкового комплекса заключается в защите слизистых  оболочек организма. Но в тоже время он является участником иммунных реакций, направленных против паразитов. Активацией IgE «заведуют» эозинофилы и макрофаги. Это важный факт в сопоставлении данных анализа при установлении диагноза болезни.

ИФА применяется для обнаружения:


  • круглых гельминтов (аскарид, остриц);
  • острой и хронической формы описторхоза;
  • трихинеллеза;
  • наличия лямблий (как дополнительный анализ);
  • форм лейшманиоза;
  • амебиаза;
  • содержания токсоплазм;

Важно: иммуноглобулины вырабатываются в организме в качестве антител к определенным антигенам. Поэтому даже при самой высокой специфичности анализа не исключаются погрешности в точности. При паразитарных заболеваниях процент вероятности составляет около 90%.

В заключение необходимо отметить, что современная иммунология постоянно находится в стадии развития, поиска новых методов диагностики и лечения заболеваний. 

Степаненко Владимир, хирург

45,065 просмотров всего, 1 просмотров сегодня

    okeydoc.ru

    Реакция организма на патогенную флору


    Для того чтобы понять, как, благодаря иммуноферментному анализу, лаборанты диагностируют различные заболевания, необходимо разобраться в физиологическом процессе, который происходит в организме во время заражения инфекциями. Когда патогенный микроорганизм попадает в кровоток, иммунная система человека демонстрирует защитную реакцию в виде выделения определенных веществ – антител. Они связываются с клеткой и анализируют, является ли она частью организма или внедрилась извне. Если иммунная система определила, что клетка чужеродная, то количество антител начинает увеличиваться с целью борьбы с патогенным микроорганизмом.

    Антитела бывают разных видов, имеют свои особенности. Одни вещества появляются непосредственно в период инфицирования, другие остаются в течение всей жизни в организме человека и именно благодаря им вырабатывается стойкий иммунитет к конкретному заболеванию. Рзделяют белковые структуры на такие виды: A, D, E, M, G. В медицине антитела называют иммуноглобулинами. Поэтому принято обозначать показатели этих веществ латинскими буквами Ig.

    Метод ифа что это«>

    Иммуноферментный анализ (ИФА) основан именно на данных медицинских знаний. С помощью специальных антигенов в лабораторных условиях можно определить наличие или отсутствие тех или иных антител в биологическом материале. По результатам такого анализа врач может поставить диагноз, а также определить не только наличие патологии, но и давность ее происхождения, выявить уровень опасности для пациента. При иммуноферментном анализе чаще других исследуют наличие антител групп M и G.

    Что представляет собой ИФА?


    На самом деле иммуноферментный анализ не является инновацией современного общества. Его изобрели еще в 80-х годах. Но для проведения таких исследований требовалась громоздкая дорогостоящая аппаратура. Поэтому использовали такой метод только в специально оснащенных научных лабораториях: его применяли для типирования клеток и тканей. А вот широкого распространения в диагностической медицине он тогда не получил, использовать его было технически сложно и крайне затратно. Лишь с развитием техники и изобретением биополимерных материалов ИФА усовершенствовали. После чего метод стал популяризироваться и завоевывать доверие в медицинских кругах.

    Как уже было сказано выше, данный метод подразумевает обнаружение в биоматериале — крови, околоплодных водах, стекловидном теле или спинномозговой жидкости — определенных групп иммуноглобулинов.

    Различают исследования без нанесения антигена на поверхность и твердофазный иммуноферментный анализ, который предполагает проведение реакции в специальных лунках. Последний метод имеет большую чувствительность и надежность, поэтому именно таким образом проводят анализ в медицинских лабораториях для обнаружения заболеваний человека.

    Фазы иммуноферментного анализа

    В зависимости от предполагаемого заболевания, из набора для иммуноферментного анализа используют необходимый антиген, который во время химической реакции при наличии инфекции свяжется с патогенной флорой. Этот процесс называется проведением иммунной реакции.


    Затем для того, чтобы визуально определить результат исследования, проводят ферментативную фазу ИФА. Она предполагает окрашивание материала с помощью специальных реагентов. В данном исследовании применяют такие ферменты, как щелочная фосфатаза, пероксидаза и авидин. В зависимости от получившегося цвета в процессе проведения химических реакций и определяют результат иммуноферментного анализа.

    Что такое колориметрия?

    Анализ ферментативной фазы диагностики проводится с помощью метода, который имеет название «колориметрия». Дело в том, что не только цвет материала дает информацию об инфекции, но и получившаяся в результате химических реакций плотность окраса. Именно этот показатель определяет концентрацию патогенного микроорганизма. Если по старинке используют ручной метод диагностики, то для определения указанных показателей выстраивают специальный калибровочный график.

    В современных лабораториях сегодня редко применяют ручной метод. Для проведения анализа ИФА используют специальный аппарат – колориметр, в котором вручную задаются лишь параметры исследования, а затем всю работу, включая построение графика, прибор проводит автоматически.

    Метод ифа что это«>

    Методы ИФА

    Различают прямой и непрямой методы иммуноферментного анализа. Первый вид занимает меньше времени, так как имеет лишь 3 стадии выполнения. Сперва к антигенам исследуемого материала, помещенным в специальные лунки, добавляют специфические антитела. Затем удаляют избыточное их количество и проводят ферментативную фазу анализа, получая таким образом результат.

    Непрямой метод применяется намного чаще, так как имеет более высокую чувствительность по сравнению с прямым способом диагностики. При его проведении используется двойное исследование. А именно — сначала антиген связывают с немеченым антителом, а затем с меченым. Такой процесс занимает больше времени, но и результат является наиболее точным.

    Наборы реагентов

    Наборы для иммуноферментного анализа выпускают разные производители, в самых разных комплектациях. В России признанной является компания «Союз медико-биологический». Данный производитель выпускает наборы реагентов для исследования методом ИФА практически всех распространенных в наших широтах инфекций, поддающихся анализу таким способом. Кроме непосредственно самих реагентов в комплекты входят дополнительные материалы, что обеспечивает безопасность, удобство и быстроту выполнения анализа. Кроме того, химические субстанции окрашены в разные цвета, что снижает вероятность ошибки в выборе реагента лаборантом.

    Метод ифа что это«>

    Отличаются химико-биологические наборы относительной доступностью, что прямо влияет на распространение и доступность иммуноферментного анализа для населения.

    Преимущества метода диагностики

    Несомненно, иммуноферментный анализ имеет ряд преимуществ по сравнению с другими диагностическими методиками:

    1. С его помощью можно определить даже незначительное наличие патогенных организмов, что говорит о высокой чувствительности теста.
    2. Возможность обнаружения заболевания на самых ранних стадиях, что значительно повышает шанс на благополучное излечение.
    3. Простота и удобство взятия биологического материала. Такой анализ проводят как в частных лабораториях, так и в государственных. При необходимости материал может взять медсестра у пациента дома.
    4. Для анализа требуется совсем незначительный объем биоматериала.
    5. Быстрое получение результата. Современное медицинское оборудование позволяет выполнить анализ в течение суток.
    6. Возможность обнаружения скрытых бессимптомных форм инфекции.
    7. Доступность исследования.
    8. При необходимости возможно проведение массовых обследований данным методом.
    9. Существует возможность отслеживания протекания заболевания и эффективности назначенного лечения, так как можно проводить анализ методом ИФА многократно абсолютно безопасно для пациента.
    10. Автоматизация этапов проведения анализа, что исключает человеческий фактор и повышает достоверность результатов.
    11. Реагенты для проведения ИФА хранятся достаточно долго – около года.
    12. Проведение анализа возможно при колебаниях температуры окружающей среды.

    Иммуноглобулины группы M

    Метод ифа что это«>

    Антитела группы М вырабатываются иммунной системой сразу после обнаружения чужеродного антигена. Следовательно, если иммуноферментный анализ завершился обнаружением таких веществ в биоматериале, то это свидетельствует об острой стадии протекания заболевания, первичном инфицировании. Иммуноглобулины группы М могут находиться в организме до месяца в зависимости от вида заражения. Затем их количество уменьшается до полного исчезновения.

    Иммуноглобулины группы G

    На смену иммуноглобулинам группы М появляются белковые структуры вида G. Эти вещества вырабатывают стойкий, в большинстве случаев пожизненный иммунитет к заболеванию. Определение белковой структуры IgG в исследуемом материале указывает на то, что организм ранее встречался с возбудителем и имеет защитную реакцию от повторного заражения.

    Показания к диагностике

    Иммуноферментный анализ крови применяют для определения разных инфекционных заболеваний, гормональных состояний, делают аллергопробы. А именно:

    • определяют уровень гормонов щитовидной железы;
    • показатели репродуктивной гормональной панели;
    • онкомаркеры;
    • обнаруживают возбудителей инфекционных заболеваний, таких как цитомегаловирус, гепатит, токсоплазма, краснуха, корь, туберкулез, хламидия, сифилис, микоплазма, уреплазма, кандида, лямблии и даже ВИЧ;
    • диагностируют аутоиммунные заболевания. В том числе часто используют для исследования гормонов щитовидной железы иммуноферментный анализ: ТТГ, ТГ, Т3 и Т4.

    Кроме диагностических целей, метод иммуноферментного анализа применяют в научно-исследовательской медицинской деятельности.

    Как проводится забор материала?

    В большинстве случаев для анализа рекомендуется забор венозной крови. После обработки и подготовки материала для исследования проводят иммуноферментный анализ сыворотки крови или плазмы.

    Особого внимания требует исследование гормональной панели, так как в данном случае крайне важно учитывать особенности забора материала. Например, диагностика большинства гормонов репродуктивной системы женщины требует взятия венозной крови в определенные дни менструального цикла. На ряд других гормонов действуют внешние факторы: сезонность, время суток, психологическое состояние пациента и многое другое. Не учитывая специфические факторы, можно получить ложный результат, что приведет к обострению заболевания или неправильно назначенному лечению.

    Метод ифа что это«>

    В некоторых, чаще осложненных случаях, для анализа могут понадобиться спинномозговая жидкость, стекловидное тело или околоплодные воды беременной женщины. Процедуры по забору этих биологических материалов несут определенный риск, имеют противопоказания и восстановительный период. Поэтому следует проводить только по показаниям врача и под его профессиональным наблюдением такой иммуноферментный анализ. Расшифровка в таком случае требует специальных медицинских знаний и может занять некоторое время.

    Подготовка к анализу

    Иммуноферментный анализ следует проводить, придерживаясь всех рекомендаций, так как на результаты исследования влияют внешние факторы. Например, важно сдавать венозную кровь натощак утром (до 11 часов). За 2 недели до предполагаемого забора материала нужно прекратить прием каких-либо лекарственных препаратов, особенно гормональных. Несколько дней перед исследованием следует воздержаться от употребления алкоголя и жирной пищи, а также исключить физическую нагрузку, переживания и стрессы.

    Расшифровка результатов

    Расшифровка результатов иммуноферментного анализа требует специальных знаний об особенностях белковых структур (антител), о которых было рассказано выше (IgG и IgM). В соответствии с этими данными анализируют показатели исследований. В таблице описаны варианты, которые могут быть получены при проведении анализа:

    Иммуноферментный анализ крови: расшифровка
    Иммуноглобулины M Иммуноглобулины G Предполагаемая расшифровка
    отрицательно отрицательно Организм никогда не сталкивался с данной инфекцией. Нет ни возбудителя, ни антител к нему.
    отрицательно положительно Организм выработал стойкий иммунитет к инфекции.
    положительно отрицательно Острая форма инфицирования.
    положительно положительно Вероятнее всего первичное заражение, но требуются дополнительные диагностические исследования.

    Анализируя представленную таблицу, можно сделать вывод, что в большинстве случаев для подтверждения диагноза потребуются дополнительные исследования. Не может дать однозначного ответа один лишь иммуноферментный анализ. Норма в данном случае не имеет четких границ: обнаруженные белки группы G указывают лишь на то, что организм ранее подвергался инфицированию определяемым возбудителем. Но этот же результат может говорить и о наличии острой фазы — важно сопоставить множество факторов и показателей для того, чтобы поставить правильный диагноз.

    Факторы риска

    ИФА является точным на 90%. Все же существуют факторы риска, которые влияют на искажение результата диагностики: неисправность аппаратуры, неправильный забор материала, его хранение и транспортировка, неучет иных внешних факторов.

    Метод ифа что это«>

    Не рекомендуется проводить диагностику после переливания крови, гемолиза, хирургических вмешательств, взятия биопсии или пункции биологического материала — это также может повлиять на результаты показателей.

    Стоимость анализа

    Стоимость диагностического исследования имеет большой диапазон и зависит от вида анализа и определяемого антигена, так как исходя из этих факторов рассчитывается стоимость реагентных наборов и определяется сложность проведения анализа. Но в большинстве случае является доступным многим пациентам иммуноферментный анализ. Цена его составляет от 300 р. до 2000 р.

    ИФА – доступный, быстрый и высокоэффективный метод диагностики большого перечня заболеваний. Но расшифровкой результатов и постановкой диагноза имеет право заниматься только квалифицированный медицинский работник.

    www.syl.ru

    Иммунная и ферментативная реакции

    Как явственно следует из названия, анализ крови ИФА включает в себя несколько составляющих, а именно – иммунную и ферментативную реакции.
    Иммунная реакция позволяет связать клеточные элементы и болезнетворные микроорганизмы, а ферментативная дает возможность визуализировать и оценить результат предыдущей реакции.

    Рассмотрим каждую реакцию более подробно.

    Что такое иммунные реакции?

    Иммунными называются специфические реакции, позволяющие связать антиген с антителом и создать иммунный комплекс. Что же это значит? В первую очередь, необходимо понимать, что любая клеточная поверхность содержит молекулы, содержащие данные о клетке, называющиеся антигенами и подразделяющимися на:

    • индивидуальные;
    • видовые.

    антигены

    Индивидуальные антигены, несмотря на некоторую схожесть, имеют и множество различий. Они имеются у одного конкретного организма и никогда не повторяются в других. Видовые антигены можно обнаружить в организмах тех или иных видов живых существ. Так, например, обезьяны, лошади или собаки имеют свой, ни на что не похожий антиген. Именно поэтому антигены этого типа используются иммунной системой для распознавания своих и чужих клеток, что, собственно говоря, и лежит в основе иммуноферментного анализа крови.

    Как распознаются антигены? Здесь все достаточно понятно. Говоря простым языком, клетка, являющаяся иммунной, отлавливает клетку, вызвавшую у нее «подозрение», и сравнивает ее антиген с имеющимся в памяти описанием. Если антиген вызвавшей сомнение клетки соответствует ему, то иммунная клетка «отпускает» ее и отправляется дальше. Если же описание отличается, то ответ организма на угрозу один – уничтожение. Причем распознавание «врага» в данном случае равняется почти 100%.

    Что собой представляет антитело?

    По своей сути антитело, имеющее огромное значение при использовании метода ИФА, является специальной молекулой, существующей на поверхности иммунной клетки и позволяющей последней связаться с антигенами сомнительного микроорганизма. Именно антитело служит проводником данных, позволяющих оценить угрозу, и именно оно получает сигнал о том, какой является сомнительная клетка – своей или чужеродной. В случае, если захваченная клетка является «своей», антитело выпускает антиген и высвобождает его «хозяйку».

    Для чего нужен иммунный комплекс?

    Как уже говорилось несколько ранее, при распознавании чужеродной клетки антитело не выпускает антиген чужеродной клетки. Наоборот, посылая определенные сигналы, оно зовет на помощь «подкрепление». В данном случае речь идет о том, что все остальные антитела, расположенные в другой части клетки, являющейся иммунной, начинают движение к участку, сигнализирующему об опасности, и связывают себя с захваченным антигеном, фиксируя его и окружая со всех сторон. После того, как антиген будет полностью окружен, начинается уничтожение чужеродного микроорганизма.

    Антитела

    Антитела, которые позволяет выявить ИФА диагностика, представляют собой белковые структуры – иммуноглобулины, подразделяющиеся на несколько видов:

    • IgA;
    • IgM;
    • IgG;
    • IgD;
    • IgE.

    Однако для диагностики берется лишь один вид антител, являющийся наиболее специфичным в отношении искомых микроорганизмов. Как правило, подобными антителами являются разновидности IgG и IgM.

    Что такое ферментативные реакции?

    Ферментативными называются реакции, позволяющие одно вещество превратить в другое. Материал, на который воздействуют в ходе исследования крови методом ИФА, носит название «субстрат», а материал, получаемый под воздействием фермента, носит название «продукт реакции». Причем особенности данного процесса таковы, что воздействовать тот или иной фермент может исключительно на конкретный субстрат. Подобное свойство фермента определять «свой» субстрат носит название «сродство». Исходя из вышесказанного, становится предельно понятно, что с каждым ферментом связана исключительно одна, специфичная исключительно для него реакция.

    При этом стоит отметить, что метод ИФА диагностики подразумевает использование не более десятка реакций ферментативного типа, вследствие которых образуются колорированные вещества, позволяющие использовать для определения концентрации возбудителя метод химической реакции – колориметрию.

    Что такое колориметрия?

    Колориметрия – это способ измерения концентрации вещества в зависимости от того, какой является плотность окраски раствора, подразумевающий использование специально предназначенного для этого прибора – колориметра.

    Причем в этом случае возможны две вариации зависимости плотности окраски раствора от его концентрации:

    • прямо пропорциональная;
    • обратно пропорциональная.

    В первом случае плотность окраски раствора увеличивается при увеличении его концентрации, во втором же плотность окраски раствора снижается при увеличении его концентрации. Технически это осуществляется следующим образом. Берутся несколько растворов, обладающих определенной концентрацией вещества, производятся замеры их плотности, и далее выстраивается график зависимости плотности окраски раствора от его концентрации. Затем измеряется плотность окраски испытуемого раствора, и по выстроенному графику находится величина его концентрации, находящаяся в соответствии с замеренной плотностью окраски раствора.

    проба на сифилис

    Причем использующиеся для замера колориметры после единичной калибровки способны сами отстроить кривую калибровки, остающуюся в их памяти и позволяющую им работать в режиме автомата. Стоит отметить, что в ИФА крови, как правило, используются такие ферменты, как авидин, пероксидаза и щелочная фосфотаза.

    Способы проведения ИФА

    В зависимости от способа проведения исследование ИФА подразделяется на прямое и обратное. Рассмотрим каждый из способов более подробно.

    Что такое «прямой иммуноферментный анализ»?

    Прямой иммуноферментный анализ подразумевает использование антител к определяемому антигену, соединенных специальной меткой, являющейся субстратом реакции, носящей ферментативный характер. Исходя из этого, прямой ИФА — это анализ забранного у пациента биологического материала, помещенного в лунки с последующим добавлением антител к антигену того или иного заболевания.

    Таким образом, при выявлении сифилиса в лунки будут добавлены антитела против сифилитических антигенов, полученные на производстве и закупленные лабораторией. Полученная смесь оставляется на время, требуемое для того, чтобы антитела захватили «свой» антиген. Причем, как было сказано ранее, антитела, запускающие реакцию, связываются и со специфической меткой.

    Ввиду того, что антител добавляется много, далеко не все они смогут захватить антиген в случае его нахождения в пробе. Для того, чтобы избавиться от лишних антител, жидкость из лунок выливается. Антитела же, связавшиеся с антигенами, остаются на их поверхности. Затем приступают ко второй части анализа на ИФА – ферментативной реакции. В лунки добавляется ферментный раствор и оставляется в них на полчаса либо на час. Вполне естественно, что добавленный фермент аналогичен метке, связывающей антитела. В конце реакции в лунке оказывается вещество, приобретшее соответственный оттенок.

    Окрашенное вещество исследуется колориметром. Причем ввиду того, что метка, имеющаяся в лунке, уже связалась с антителами, концентрация окраски образовавшегося там вещества будет соответствовать концентрации антител, аналогичной по размеру количеству антигенов. Таким образом, анализ позволяет понять, сколько выявляемых микроорганизмов или гормонов содержится в забранной пробе.

    Что такое непрямой иммуноферментный анализ?

    Непрямой анализ крови на ИФА производится в 2 этапа. На первом этапе используются антитела без меток, добавляемые к требуемым определения антигенам, а на втором – антитела с метками к первым антителам без меток. Таким образом удается осуществлять двойной контроль реакции:

    • антитела осуществляют связь с антигеном;
    • следующие антитела связываются с антителами, связанными с антигеном.

    Осуществляется анализ следующим образом. У пациента забирается биологический материал, вносится в лунки и оставляется до того момента, пока антигены не приклеятся к их поверхности. Затем к нему добавляются антитела без меток и оставляются на время, требуемое для того, чтобы они связались с имеющимися антигенами, создав требуемый иммунный комплекс. После того, как процесс связывания будет окончен, излишние антитела удаляются посредством выливания жидкости из лунок.

    По окончании этого процесса берутся следующие антитела (помеченные), добавляются в лунки и оставляются на время, требуемое для образования комплекса из 2-х антител и антигена. Затем раствор также выливается (с целью удаления излишних антител).

    На следующем этапе непрямого анализа крови методом ИФА вносится фермент, превращающий «метки» в вещество, имеющее цвет. Развитие окраски в данном случае занимает от пяти минут и до получаса. После проявления окраски производят колориметрию и определяют концентрацию раствора, имеющего окраску. Ввиду того, что данная величина в указанном случае соответствует концентрации антител с метками, которая равна концентрации антигена, в конце исследования можно получить представление о количественном содержании возбудителя заболевания.

    venerologiya.ru

    Что такое иммуноферментный анализ

    Назначаемый для максимально полной комплексной оценки состояния здоровья, иммуноферментный анализ позволяет оценить общее состояние здоровья и дать оценку его защитным функциям. Данное лабораторное исследование позволяет диагностировать инфекционные, аутоиммунные, гематологические патологии при анализе крови.

    Суть иммуноферментного анализа рассмотрена в видео ниже:

    Кому его назначают

    Данное исследование может быть назначены тем больным, у которых выявляется наличие следующих заболеваний:

    • аллергические реакции;
    • болезни вирусного происхождения, к которым относятся гепатиты, вирус Эпштейн-Барр, герпес, цитомегаловирус;
    • заболевания, которые передаются половым путем — хламидиоз, трихомонада, сифилис, уреаплазма, микоплазма;
    • иммунодефицит;
    • нейросифилис;
    • онкологические патологии;
    • проведение предоперационного комплексного обследования.

    Врачом может быть назначен данный анализ для установки стадии имеющегося заболевания, что позволяет своевременно вносить корректировки в применяемое лечение. А высокая точность получаемых данных позволяет иметь максимально развернутую картину здоровья. При этом получение данных после проведенного исследования происходит в очень короткий промежуток времени, что позволяет отслеживать динамику развития патологического процесса.

    Зачем сдавать такие анализы

    immunofermentnyj-analizПоскольку благодаря ИФА анализу крови можно получить значительное количество информации о состоянии здоровья и патологических процессах, происходящих в организме, именно он дает возможность наиболее полно учитывать исходные данные (общее состояние здоровья, стадия заболевания, динамика развития патологического процесса, показатель эффективность применяемой терапии) при составлении схемы лечения.

    По этой причине для получения наиболее выраженного результата лечения и быстрейшего прекращения патологического процесса в организме назначается ИФА анализ крови. Серьезные заболевания иммунной системы, наличие антигенов в крови и причины аллергии на основе полученных данных можно вылечить более быстро, применяя наиболее результативные методы.

    Назначение ИФА анализа проводится при множестве патологий, и делать его следует только по назначению врача. Частота проведения анализа также устанавливается врачом, и при сдаче крови для проведения ИФА анализа картина болезни наиболее полная. Поскольку получение динамики течения болезни возможно при сдаче данного анализа более одного раза, наиболее часто может назначаться сдача крови от трех до пяти раз. Это дает возможность сравнить количество антител в крови в различные временные промежутки.

    Виды такой процедуры

    Существует несколько разновидностей иммуноферментного анализа. Различаются они видом взятой жидкости из организма человека, на основании которой проводится изучение ее состава и наличия определенных антигенов.

    При этом для анализа может браться не только кровь человека, но и другие его жидкости:

    • околоплодные воды,
    • спинномозговая жидкость,
    • содержимое стекловидного тела,
    • мазки,
    • слизь из уретры и цервикального канала.

    Проведение самой операции по взятию определенного вида жидкости стандартный и проводится в условиях дневного стационара.

    Показания для проведения

    Обычно ИФА анализ назначается врачом при необходимости получения развернутой картины текущего заболевания, проходящего в любой форме: хронической, вялотекущей либо острой. И показаниями к проведению данного вида анализа могут считаться следующие состояния и лечебные цели:

    • поиск антигенов определенных заболеваний;
    • определение гормонального статуса;
    • выявление в организме вируса гепатита;
    • исследование на наличие онкомаркеров;
    • поиск антител к любому виду инфекционного заболевания;
    • обследование на наличие аутоиммунных поражений организма.

    Также иммуноферментный анализ назначается для выявления наличия поражения организма гельминтами и кишечными паразитами и имеющихся аллергических проявлений. При проведении выбранного метода лечения имеющегося заболевания этот анализ позволяет увидеть динамику процесса излечения, а также внести в него необходимые корректировки.

    О проведении иммуноферментного анализа смотрите в видео ниже:

    Противопоказания для проведения

    Противопоказаний для иммуноферментного исследования на сегодняшний день не выявлено.

    При беременности, когда наблюдается постоянное изменение содержания в крови гормонов, необходимо неоднократное проведение данного анализа для подтверждения полученного результата. Новорожденные и дети грудного возраста могут также иметь некорректные данные анализа: во время внутриутробного развития определенные виды антител могут проникать в кровь плода через плаценту матери. Потому их наличие во взятом анализе не следует считать признаком имеющейся инфекции.

    Безопасность анализов

    Проведение процедуры взятия любого вида жидкости из организма человека не приносит никакого отрицательного воздействия на организм. Полная стерильность при совершении манипуляций позволяет избежать вероятность заражения любыми видами заболеваний.

    Подготовка к проведению

    Для получения анализа может использоваться любой вид жидкости организма человека. Однако наиболее распространенным следует считать сыворотку крови. Кровь берется у пациента натощак, полностью исключается прием любого вида лекарств, поскольку они могут существенно влиять на общую картину результата. Прекращение приема специфического лечения, назначаемого при антибактериальном, противовирусном, противопаразитарном воздействии, осуществляется за недели перед проведением исследования.

    Как проходит процедура, ощущения во время нее

    immunofermentnyj-analiz-tsenaДля проведения ИФА анализа кровь у пациента берется строго натощак: следует не принимать пищу в каком-либо виде не менее чем за часов до процедуры. Анализ берется из локтевой вены.

    О наличии любых заболеваний и принимаемых лекарствах сообщается врачу заранее, наиболее часто препараты на момент сдачи крови будут отменены. Ощущения во время проведения процедуры сходны со взятием крови для проведения биохимического анализа.

    Далее рассмотрена расшифровка результатов и указана норма рекции иммуноферментного анализа крови.

    Расшифровка результатов

    ИФА-диагностика позволяет определить наличие инфекции в организме, активность патологического процесса и этиологию имеющейся инфекции. Быстрое получение результата проведенного анализа (в течение суток) — одно из преимуществ данного вида исследования.

    Процесс расшифровки полученной информации осуществляет врач. При этом следует учитывать, что корректность полученных результатов по динамике любых процессов гарантируется при прохождении анализов в одной лаборатории.

    Далее будет рассмотрена цена на иммуноферментный анализ (метод ИФА) крови на паразитов и иные патологии.

    Средняя стоимость процедуры

    Средняя цена ИФА-исследования зависит от направленности анализа и определения конкретных величин. Так, определение серологических маркеров инфекционных заболеваний различных видов (anti-HAV IgG, anti-HAV IgM, HBsAg) будет стоить от 200 до 320 рублей и проводится в течение 2 рабочих дней. Показатель стоимости данной процедуры считается также его преимуществом: доступность цен на любые виды исследований позволяет проводить исследование при любом размере бюджета.

    Стоимость ИФА-исследования зависит от политики медицинского учреждения, однако его следует считать общедоступной процедурой, позволяющей получить развернутую картину имеющегося заболевания и обеспечить максимально полное лечение.

    Про нормы и особенности ИФА-исследования смотрите в видеоролике ниже:

    gidmed.com

    5.1 Сущность и классификация ИФА.

    ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для индификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участие Е.Энгвалл и Р.Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р.Шурс.

    Метод ифа что это

    Рис. 6 Основной принцип ИФА:

    1. для выявления антигенов; 2) для выявления антител

    Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 6).

    Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.

    Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.

    Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой:

    [AT]+[АГ]↔[АТАГ]

    Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

    Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

    1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

    2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

    3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал. В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:

    1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы.

    А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.

    Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

    2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные.

    Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных.

    В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.

    При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.

    Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.

    Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия – образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.

    3. По принципу определения тестируемого вещества:

    А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.

    Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

    5.2 Характеристика компонентов, используемых в ИФА.

    Ферменты.

    Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

    Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:

    – высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;

    – наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;

    – возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;

    – отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.

    В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

    Субстраты.

    Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

    Основные требования к субстрату:

    – обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;

    – образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;

    – субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.

    Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемипюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.

    Образование конъюгата.

    Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Образование коньюгата – один из важных этапов проведения ИФА.

    При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент — способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело — антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

    Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

    Наиболее широкое распространение получили ковалентные способы приготовления конъюгатов. Выбор реакции связывания определяется типом доступных функциональных групп в данных белковых молекулах. В качестве реагентов, используемых для введения фермента в молекулы антигенов и антител, используют глутаровый альдегид, периодат натрия и др.

    Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида. Могут образовываться конъюгаты различных размеров с редуцированной ферментативной активностью (15 — 60 % от свободного фермента). Образовавшийся конъюгат больших размеров может стерически затруднять определение тестируемого вещества. Конъюгаты с относительно низкой молекулярной массой состоят из Fab-фрагмента и одной молекулы фермента.

    В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фермента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1-2 молекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую ферментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких образовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 — 10 %).

    Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70-90 % от начального количества фермента).

    Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:

    — высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, уменьшить неспецифическое связывание;

    — достаточной специфичностью в рабочем разведении;

    — преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные формы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;

    — оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);

    — достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство определяется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.

    5.3 Гетерогенные методы ИФА.

    Гетерогенные ИФА (или твердофазные ИФА) включают методы, в которых анализируемое соединение находится в двух фазах. Для разделения компонентов иммунохимической реакции используют твердую фазу (нерастворимый носитель, как правило, пластик) с иммобилизованными на ней антителами или антигеном, которую отмывают на каждой стадии с целью удаления промежуточных продукто непрореагировавших компонентов.

    Иммобилизацию можно проводить путем ковалентного связывания антител (антигенов) с активированным носителем, используя химические подходы, а также путем физической адсорбции антител (антигенов) на поверхности твердых полимеров (например, полистирольных пластин). В зарубежной литературе это направление получило название ELISA-тест или энзимсвязанный иммуносорбентный метод (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay).

    Неконкурентный ИФА определения антигенов на примере использования меченых ферментом специфических антител и иммобилизованных антител.

    К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации образуется специфический комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся антигенов и добавляют меченые антитела – конъюгат. При этом количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству антигена в исследуемом образце. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата добавляют хромогенный субстрат для используемого фермента, который изменяет цвет под действием фермента, т. е. происходит ферментативная реакция с окрашиванием раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству меченых ферментом специфических антител, фермента и, соответственно, исследуемого антигена. Измерения оптической плотности раствора в лунках при определенной волне (в зависимости от используемого субстрата) проводят с помощью специальных спектрофотометров, адаптированных для микропланшетов – ридеров. Количественную оценку концентрации антигена в пробе определяют, сравнивая результаты с калибровочной кривой зависимости оптической плотности раствора от концентрации стандартного раствора антигена.

    Метод ифа что это

    Рисунок 7.

    Поскольку на стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается связанным с молекулами иммобилизованных и меченых антител, в литературе этот метод часто называют «сэндвич»-метод (от англ. sandvich) или двухцентровый метод ИФА (от англ. two-site assay).

    Этот метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых имеется, по крайней мере, две антигенные детерминанты. Для анализа большого количества моновалентных антигенов (лекарственных соединений, пестицидов и др.) он неприемлем.

    Основное достоинство данного метода – высокая чувствительность. Предел обнаружения соединений данным методом в настоящее время достигает величины порядка 10-21 моль, что соответствует обнаружению в образце всего 600 молекул анализируемого вещества. Максимальная чувствительность достигается при проведении каждой иммунологической реакции в равновесном режиме, что сказывается на длительности проведения анализа, которая в среднем составляет 4 – 6 часов. Неконкурентный ИФА определения антител на примере использования меченых ферментом вторичных антител и иммобилизованных антигенов.

    К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и отмывания от несвязавшихся антител добавляют меченые вторичные антитела, которые специфичны к анализируемым антителам. После вторичной инкубации и удаления избытка меченых вторичных антител содержание ферментной метки на носителе пропорционально концентрации специфических антител в сыворотки.

    Данная схема является одной из наиболее распространенных ИФА определения антител, поскольку позволяет выявлять антитела к разным антигенам.

    Гетерогенный конкурентный ИФА определения антигена на примере использования меченого антигена и иммобилизованных антител.

    К иммобилизованным на носителе антителам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген и фиксированную концентрацию конъюгата антигена с ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена.

    Метод ифа что это

    5.4 Гомогенный метод ИФА.

    Гомогенный иммуноферментный анализ (ГИФА) — наиболее простой в методическом отношении вид ИФА. При его постановке один из участников иммунной реакции (обычно это низкомолекулярный антиген) метится ферментом и за ходом формирования комплекса антиген-антитело следят, регистрируя изменение активности фермента.

    Такое нарушение ферментативной активности может возникать либо за счет пространственного разобщения фермента и субстрата, либо за счет конформационных изменений в молекуле фермента, сопровождающих формирование иммунного комплекса. ГИФА имеет ряд существенных преимуществ перед другими иммунохимическими методами. Во-первых, высокая экспрессия (весь анализ с помощью ГИФА , занимает минуты и даже доли минут).

    Метод ифа что это

    Рис.8 Варианты гомогенного иммуноферментного анализа(А- эффект разобщения фермента (Ф) и субстрата (С) за счет стерических препятствий при взаимодействии антигена (Аг) и антитела (Ат); Б- эффект изменения конформации фермента при формировании комплекса антиген- антитело).

    Во-вторых, метод имеет одну стадию и не требует трудоемких и требующих времени этапов промывки. И наконец, в-третьих, метод требует минимальных объемов (8-50 мкл) и количеств биологического или клинического образца. Однако у метода ГИФА имеется один крайне существенный недостаток — на его основе можно создавать диагностические тест-системы только для низкомолекулярных антигенов. Только, в этом случае антитело, взаимодействуя с антигеном, может эффективно экранировать или модифицировать связанную с этим антигеном молекулу фермента. Именно в связи с этим, ( несмотря на кажущуюся простоту и очевидные преимущества перед другими методами, на основе ГИФА были созданы диагностикумы для выявления только гормонов, пептидов, лекарственных и наркотических веществ и некоторых низкомолекулярных белков.

    5.5 «Сэндвич» — вариант ИФА для выявления антигенов.

    Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повторяющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфичности.

    При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все остальные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело.

    Основные этапы анализа:

    studfiles.net


Leave a Comment

Adblock
detector